Bei biologischen Kryo-TEM-Experimenten spielt die erreichbare Auflösung eine sehr große Rolle. Lange Zeit war es unmöglich, Strukturen zu untersuchen die kleiner waren als 3 Å. Der limitierende Faktor war die Auflösung der verwendeten TEM-Kameras, bei denen es sich um traditionelle Szintillator-gekoppelte CCD/CMOS-Kameras handelte. Abbildung 1 zeigt, welchen Einfluss die Entwicklung der sogenannten Direct-Detection-Kameras für die biologische Kryo-TEM-Forschung hatte.
Abb. 1: Anzahl der in der EMDataBank (http://www.emdatabank.org/) gemeldeten Strukturen, gruppiert nach gemeldeter Auflösung.
Aufgezeigt ist die zeitliche Entwicklung der Anzahl der veröffentlichten Untersuchungen für biologische Strukturen hinsichtlich deren Auflösung für 2, 3 und 4 Å. Im Jahr 2011 gab es die erste Veröffentlichung, in der eine Direct-Detection-Kamera genutzt wurde. Bridget Carragher und Clint Potter vom The Scripps Research Institute verwendeten eine DE-12-Kamera von Direct Electron. In den darauffolgenden Jahren löste diese Art Kamera die traditionellen CCD-Kameras ab, was zu einem rapiden Anstieg an untersuchten Strukturen im 2-4 Å-Bereich führte. Seit 2014 ist es nun auch möglich, Strukturen unterhalb von 3 Å aufzunehmen. Eine Option, die lange Zeit als nicht möglich galt.
Mittlerweile hat sich aber herausgestellt, dass die Auflösung bei biologischen Kryo-TEM-Experimenten nicht mehr der alles entscheidende Faktor ist. Viel wichtiger ist es, die Güte der aufgenommenen Bilder zu verbessern und die Geschwindigkeit der Bildaufnahme zu erhöhen. Scott Stagg von der Florida State University benötigte so für die Aufnahme der in Abbildung 2 gezeigten Struktur (ca. 2,9 Å Auflösung) nur knapp drei Tage. Er verwendete dafür eine DE-20-Kamera von Direct Electron, die an ein Titan-Krios-TEM montiert wurde.
Abb. 2: Kryo-EM-Modell und Messergebnis einer Variante eines AA-Virus (adeno-associated virus) mit einer Auflösung von ca. 2,9 Å. Die zugrunde liegenden Daten wurden in nur drei Tagen erfasst.
Direct Electron hat in den letzten Jahren die Entwicklung dieser Kameras vorangetrieben und bietet mit der DE-64 die derzeit beste Kamera für biologische Kryo-TEM-Experimente an. DE-64 ist die einzige Direct-Detection-Kamera mit einem 8 k x 8 k-Sensor, was einem Bildbetrachtungsfeld von 67,1 Megapixeln entspricht.
Im Vergleich zu anderen Direct-Detection-Kameras, die über ein 4 k x 4 k-Sensorfeld verfügen, bietet sie folgende Vorteile:
- Es werden weniger Bilder für Einzelpartikeluntersuchungen benötigt.
- Auch große Objekte (z. B. Viren) können im Ganzen untersucht werden.
- Die 3D-Rekonstruktion wird durch verfeinertes CTF-Fitting deutlich verbessert.
- Eine hohe Bildrate sorgt für eine schnellere Bildaufnahme.
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