Kryo-Rasterelektronenmikroskopie –
Eiszeit im REM-Labor

Mit der Kryo-Rasterelektronen­mi­­kro­­skopie können wasserhaltige oder sensible Proben in ihrem natürlichen Zustand beobachtet werden. Ein Rasterelektronenmikroskop (REM) arbeitet bei vermindertem Druck von 1 x 10^-1 bis 1 x 10^-5 Pa (10^-3 und 10^-7 mbar) und einer Temperatur von ca. 295 K (22 °C). Unter diesen Bedingungen ist Wasser gasförmig und nicht für die Elektronenmikroskopie geeignet. Durch starkes Abkühlen der Probe gelingt es, die Sublimation von Wasser stark zu verlangsamen. So können auch stark wasserhaltige Proben untersucht werden.

Anwendungen für Kryo-Methoden finden sich in den Bereichen Kunst­stof­fe, Textilien, Proben mit niedri­gem Schmelzpunkt (Öle, Farben, Lac­ke), Suspensionen (Kos­metika, Phar­m­a­zeutika) und biologische Proben (Pflanzen, Pilze, Gewebe, Organismen). Besonders interessant ist die Darstellung und Untersuchung von Reaktionen wie bei der Abbindung von Zement.

Bei einer typischen Kryo-Präparation werden als Erstes die zu untersuchenden Proben sehr schnell eingefroren damit sich z. B. bei wässrigen Pro­ben keine großen Eiskristalle bilden, die das Probenmaterial schädigen. Zum Schockgefrieren kann unter anderem „slushy“-Stickstoff genutzt werden. Das ist ein sehr kaltes Stickstoffgel (ca. -210 °C), welches die Probe besser benetzt als flüssiger Stickstoff und damit auch schneller einfriert. Der Grund für die langsame Abkühlung der Probe mit Flüssigstickstoff liegt in der Bildung eines isolierenden Gaspolsters (Leidenfrost-Effekt). An­dere Methoden zur Kryo-Fi­xierung sind Hochdruckgefrieren, Me­tall­­spie­gel­fixierung, Einfrieren durch einen Kühlmittelstrahl etc..

Im zweiten Schritt wird die tiefgefrorene Probe in eine Vakuumkammer transferiert und dort präpariert. Dazu wird sie mit einer elektrisch leitfähigen Schicht aus Kohlenstoff oder Metall (z. B. mit Iridium für hochauflösende REM-Bilder) versehen oder gebrochen. Dies erlaubt einen Blick ins Innere der Probe. Anschließend wird die Probe unter Kühlung (normale Arbeitstemperatur -140 °C) in das Ras­terelektronenmikroskop verbracht und dort unter ständiger Kühlung untersucht.

Diese auf den ersten Blick aufwendige Prozedur verhindert Proben­schrumpfung und Oberflächen­verzer­rungen, wie sie, wenn auch in geringem Umfang, sowohl bei der Kritsch-Punkt-Trocknung als auch bei der Gefriertrocknung von wässrigen Pro­ben auftreten. Zudem ist die Trocknung mit überkriti­schem Kohlenstoffdioxid (Kritsch-Punkt-Trocknung) begrenzt auf Stoffe, die nicht sensibel auf Lösungsmittel (Ethanol oder Aceton) reagieren, zum Beispiel Wachse auf der Oberfläche von Blättern (Lotus-Effekt). Die typische Kryo-Prä­pa­ra­tionszeit beträgt ca. 10 Minuten vom Ein­frieren der Probe bis zum Einschalten des Elektronenstrahls. Im Fall der Gefrier­trock­nung kann die Trocknung einige Stunden bis Tage dauern und eine Pro­ben­schrumpfung bewirken. Ein Brechen der Proben in gefrore­nem Zustand (Gefrierbruch) liefert zusätzlich Informationen über das Pro­ben­innere. Durch eine gezielte kurzzeitige Temperaturerhöhung der Probe auf -80 °C kommt es zur Sublimation von Oberflächenwasser und damit verbunden zu einer Frei­legung feinster Strukturen. Die neue Generation der Kryo-Prä­pa­ra­tionssysteme macht Tieftem­pera­tur­prä­paration sehr viel einfacher, schneller und reproduzierbarer als früher. Die On-Column-Systeme werden über einen geeigneten Flansch an das Mi­kro­skop angebaut. Die Präpa­ra­tions­kammer wird unter Hoch­va­kuum gekühlt und beinhaltet alle Einrichtungen für die Präparation (Brechen, Beschichten) sowie eine Pro­benschleuse.

Mit diesen Systemen kann die Probe sehr viel schneller nachpräpariert werden um z. B. einen weiteren Gefrierbruch durchzuführen oder mehr Beschichtungsmaterial aufzutragen als mit einem Off-Column-System. Außerdem bleiben auch bei einer Nachpräparierung die Druck­verhältnisse konstant und die Pro­be durchgängig gekühlt. Mit der On-Column-Präparation können dynami­sche Reaktionen verfolgt und angehalten oder wie z.B. bei Zement­ab­bindung stark verlangsamt werden.