Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) ermöglicht Einblicke in Oberflächenstrukturen mit einer Auflösung im Nanometerbereich. Um jedoch unter den hohen Vakuumbedingungen des REMs klare und detaillierte Abbildungen biologischer Proben zu erhalten, ist eine spezielle Probenvorbereitung notwendig. Durch die hohe Oberflächenspannung von Wasser (72,86 mN/m bei 20 ℃) kann die vakuuminduzierte Verdampfung von Wassermolekülen in biologischen Proben zu strukturellen Verformungen und Bildverzerrungen führen. Daher muss Wasser vor der elektronenmikroskopischen Untersuchung entfernt werden, um präzise Ergebnisse sicherzustellen.
Die Kritisch-Punkt-Trocknung (KPT), auch als überkritische Trocknung bekannt, ist eine besonders effektive Methode zur Probenvorbereitung für die REM. Im Vergleich zu Luft- oder Gefriertrocknung ermöglicht sie den Erhalt empfindlicher morphologischer Strukturen. Dies wird in Abbildung 1 verdeutlicht: In 1a ist ein Tomatenblatt abgebildet, das durch Lufttrocknung deformiert wurde, während in 1b ein mittels KPT getrocknetes Tomatenblatt seine Strukturen bewahrt hat.

Das Prinzip der KPT beruht auf der Verdampfung von CO₂ an dessen kritischem Punkt (31,1°C, 73,8 bar; Abbildung 2), an dem die Oberflächenspannung auf null sinkt. Dadurch können struktureller Kollaps und Schrumpfung, wie sie bei Luft- oder Gefriertrocknung auftreten, vermieden werden.
Da CO₂ nicht mit Wasser mischbar ist, wird eine Zwischenflüssigkeit benötigt, um das Wasser aus den Proben zu entfernen. Üblicherweise werden Ethanol oder Aceton verwendet, da sie sowohl mit Wasser als auch mit CO₂ mischbar sind. Nach der üblichen Fixierung (z.B. mit Glutaraldehyd oder Formalin) und anschließender Pufferwäsche zur Entfernung des Fixiermittels erfolgt die Entwässerung der Proben. Diese werden schrittweise in höhere Konzentrationen der Zwischenflüssigkeit überführt, bis sie schließlich in 100 % Ethanol oder Aceton vollständig entwässert sind. Um ein Austrocknen zu vermeiden, werden die Proben mit der Zwischenflüssigkeit in den Kritisch-Punkt-Trockner überführt.
Je nach Gerät erfolgt dann der Trocknungsprozess manuell oder automatisiert. Zunächst wird die Zwischenflüssigkeit durch flüssiges CO₂ ersetzt. Mehrere Spülvorgänge stellen sicher, dass die Zwischenflüssigkeit vollständig entfernt wird. Anschließend wird das CO₂ in der Kammer langsam erhitzt. Durch den steigenden Druck überschreitet das System den kritischen Punkt von CO₂ (Pfad A → B in Abbildung 2), was durch das Verschwinden des Meniskus im Sichtfenster erkennbar ist. Beim anschließenden langsamen Druckabbau, während die Temperatur konstant bleibt (Pfad B → C), wird die Probe schonend getrocknet, ohne den Phasenübergang von Flüssigkeit zu Gas zu durchlaufen (Pfad A → D). Dadurch bleiben die ursprünglichen Strukturen der Probe erhalten, wie erneut am Vergleich der Tomatenblätter in Abbildung 1 deutlich wird.
Nach der KPT sollten die Proben auf einen Probenstub aufgebracht und idealerweise mit einer leitfähigen Beschichtung, wie z.B. Gold oder Platin, versehen werden, bevor sie im REM untersucht werden.
Bei Fragen zur Kritisch-Punkt-Trocknung oder zur Probenpräparation stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung.

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