Laser Beam Shaping per la microscopia ottica Cailabs

Utilizzati da secoli per l'imaging e la diagnosi medica, i microscopi ottici producono immagini di campioni o oggetti invisibili a occhio nudo. Essenzialmente costituiti da una sorgente di luce, lenti, specchi e un obiettivo che ingrandisce l'oggetto per renderlo visibile all'occhio o alla telecamera, generano immagini di organismi o tessuti viventi su scala cellulare.

Per generare il contrasto dell'immagine a livello del campione si possono utilizzare diversi metodi ottici: contrasto di fase, contrasto di interferenza differenziale e contrasto di eccitazione di fluorescenza. L'imaging a fluorescenza è la più utilizzata tra le tecniche di microscopia ottica. Consiste nell'attivare la fluorescenza proiettando un raggio laser di eccitazione di una certa lunghezza d'onda su un campione marcato con fluorofori, utilizzando coloranti organici, biomarcatori fluorocromatici, proteine fluorescenti, ecc. Il segnale di fluorescenza ottenuto viene quindi utilizzato per visualizzare l'organizzazione delle particelle all'interno delle cellule.

Schema del fenomeno della fluorescenza 

I microscopi ottici possono essere suddivisi in due categorie principali in base alla tecnica di analisi del campione utilizzata:

• Microscopia a campo largo - l'intero campione è esposto a una sorgente luminosa e l'immagine è direttamente osservabile dall'occhio o da una telecamera.   Questa tecnica è ideale per osservare campioni sottili perpendicolarmente all'asse ottico. Questa categoria comprende sia la microscopia in campo chiaro che quella in campo scuro.
• Microscopia a scansione laser - un'immagine 2D o 3D del campione viene generata utilizzando una sezione ottica. Questa tecnica prevede la scansione del campione punto per punto con il raggio laser. Un algoritmo ricostruisce l'immagine, che viene trasmessa all'osservatore. La microscopia confocale e la microscopia a eccitazione a due fotoni utilizzano questa tecnologia per generare immagini a più alta risoluzione.

Introdotta negli anni '90, la microscopia a super-risoluzione, o nanoscopia, utilizza la fluorescenza e le due tecniche di analisi del campione sopra menzionate. Essa mira a superare il limite fisico di diffrazione (criterio di Abbe), che limita la risoluzione delle immagini dei microscopi ottici convenzionali a 200 nm. Un software specifico e una gestione efficace delle sorgenti luminose consentono oggi di ottenere una risoluzione delle immagini fino a 20 nm. Esistono tre tipi principali di microscopia a super-risoluzione:

• Stimulated Emission Depletion (STED) - questa tecnica utilizza la scansione laser e la microscopia a fluorescenza per ridurre le dimensioni del fascio di luce sovrapponendolo a un fascio di depletione a forma di ciambella;
• Microscopia a illuminazione strutturata (Structured Illumination Microscopy, SIM) - il campione viene illuminato con un modello di luce strutturata (modello Moiré) da diverse angolazioni, almeno nove per un'immagine 2D. Un algoritmo viene poi utilizzato per ricostruire l'immagine;
• Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM) - questo metodo di microscopia a fluorescenza si basa sul fenomeno di "blinking" stocastico dei fluorofori per fornire risoluzioni spaziali ottimali (STORM, d-STORM, PAINT, PALM).

Tuttavia, i dispositivi di microscopia devono ancora affrontare alcune sfide. I sistemi personalizzati di Cailabs migliorano le prestazioni dei microscopi ottici:

I fasci laser gaussiani sono attualmente utilizzati nei microscopi e il loro profilo serve a ottenere un'immagine uniforme dei campioni. La tecnologia MPLC ( Multi-plane light conversion) consente di modellare il fascio omogeneo in modo ultra-stabile con un uso efficiente dell'energia laser, aumentando così la resa e la qualità del processo.

• Per migliorare la raccolta del segnale di fluorescenza, la forma personalizzata del fascio "top-hat" (ad esempio, quadrato per la microscopia a campo largo, linea per una scansione laser efficiente, ad anello, forme complesse, ecc) permette di adattare l'illuminazione all'area di destinazione per ottenere immagini di migliore qualità.⁽¹⁾
• In ricezione, Cailabs propone soluzioni per aumentare la sensibilità del segnale e la risoluzione delle immagini utilizzando un approccio modale. L'utilizzo della tecnologia MPLC come analizzatore  di modalità sfrutta sia l'intensità che la fase all'uscita del microscopio.⁽²⁾

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^Riferimenti:

^{(1) Rowlands, C.J., Ströhl, F., Ramirez, P.P.V. et al. Flat-Field Super-Resolution Localization Microscopy with a Low-Cost Refractive Beam-Shaping Element. Sci Rep 8, 5630 (2018).} 

^{(2) Martin Poinsinet de Sivry-Houle, Simon Bolduc Beaudoin, Simon Brais-Brunet, Mathieu Dehaes, Nicolas Godbout, and Caroline Boudoux, “All-fiber few-mode optical coherence tomography using a modally-specific photonic lantern,” Biomed. Opt. Express 12, 5704-5719 (2021).}