Kann ich die Orientierung meiner Proteine in der Kryo-TEM beeinflussen?

Vor allem in der Kryo-TEM hängt der Erfolg der Probenpräparation stark von den Oberflächeneigenschaften des Netzchens, beziehungsweise des Trägerfilms auf dem Netzchen, ab. Trägerfilme sind typischerweise dünne Kohlefilme, (kohlebeschichtetes) Formvar oder ähnliches.
Diese sind nach der Herstellung meist hydrophob und daher schlecht benetzbar. In der Kryo-TEM sind viele Proben Proteine oder Moleküle, die sich in einem flüssigen Medium befinden.

Um eine gleichmäßige Verteilung dieser Teilchen auf dem Trägerfilm zu erreichen, ohne dass diese z.B. verklumpen und nicht mehr einzeln dargestellt werden können, muss die Oberfläche hydrophil sein. Die Grafik in Abbildung 1 veranschaulicht die Bedeutung der Benetzbarkeit. Je kleiner der Kontaktwinkel Θ ist, umso weniger können sich dicke Tropfen ausbilden und die Flüssigkeit, mit den Teilchen darin, kann sich viel besser auf dem Trägerfilm verteilen. Dies kann mittels Glimmentladung in einer Vakuumkammer erreicht werden. Zündet man durch die Glimmentladung ein Plasma in reduzierter Luft, erhält man eine hydrophile, negativ geladene Oberfläche. Verwendet man eine andere reduzierte Atmosphäre, z.B. mit Alkylaminen oder Methanol, oder eine entsprechende Nachbehandlung, so kann man auch positiv geladene hydrophile oder aber hydrophobe (+/-) Oberflächen erzeugen. Abb. 2 zeigt, welchen Unterschied die Oberflächenbehandlung im Falle von menschlichen 20S Proteasomkomplexen machen kann. Erfährt der Trägerfilm eine Behandlung mit Luftplasma (a) ist die Orientierung der Proteinkomplexe vorzugsweise so, dass es sich um eine Draufsicht handelt, während man nach Beglimmung unter Amylaminatmosphäre (b) eine Seitenansicht der Proteinkomplexe erhält. Betrachtet man nur die Daten aus (a), könnte man meinen, die Proteinkomplexe hätten die Form eines Donuts. Die Seitenansicht belehrt jedoch eines Besseren: Von hier aus sehen sie eher wie eine Ziehharmonika aus. Aufnahmen von anderen Orientierungen sind vor allem dann hilfreich, wenn die Proteine der hohen Strahlenbelastung einer Elektronentomographie nicht standhalten können.

Der GloQube Plus wurde speziell im Hinblick auf die Präparation von Probennetzchen in der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) entwickelt. Über ein Glasfläschchen können Chemikalien dem Beglimmungsprozess zugeführt werden. Der Prozess ist komplett automatisiert: die Software steuert neben der Beglimmung sowohl das Abpumpen der Vakuumkammer als auch das Einlassen von Luft und Chemikaliendampf. Durch das Zweikammersystem des GloQube Plus – eine „Clean“ und eine „Vapour“ Kammer – wird eine Kontamination durch Prozesschemikalien in der „Clean“-Kammer vermieden. Ein langsames Belüften kann eingestellt werden, um empfindliche Proben wie TEM-Netzchen nicht aufzuwirbeln.

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