Kraftmessung von molekularen Motoren in lebenden Zellen – Optische Pinzette mit integriertem Kraft-Sensor
Abb: 1: Darstellung der benötigten Kraft zum Blockieren eines mit Kinesin gekoppelten Lipidvesikels gemessen mit dem LunamTM T-40i
Abb: 2: Histogramm zur Darstellung der maximal nötigen Kraft zum Blockieren eines mit Kinesin gekoppelten Lipidvesikels gemessen mit dem LunamTM T-40i. Ein Peak liegt bei 3,2 , weitere bei Vielfachen von 3,2 pN (n = 400)
In lebenden Zellen sind Transport- und Bewegungsprozesse von überragender Bedeutung. Sowohl bei der Teilung von Zellen, als auch bei der Lokomotion und dem intrazellulären Transport von Vesikeln und Organellen spielen molekulare Motoren eine Schlüsselrolle. Daher ist die Untersuchung der Funktion dieser Motoren, z. B. Kinesin, entscheidend für das Verständnis von Bewegung im zellularen Maßstab. Seit etlichen Jahren sind Methoden zur direkten Manipulation von Mikro- und Nanopartikeln in Flüssigkeit bekannt, das wichtigste Werkzeug unter ihnen ist die optische Pinzette. Neben der Möglichkeit Partikel zu manipulieren ist die Bestimmung von Kräften, die von molekularen Motoren ausgehen, von größtem Interesse. Optische Pinzetten sind für eine solche Messung hauptsächlich bei In-vitro-Experimenten geeignet und konnten leider nur unter großen Schwierigkeiten innerhalb lebender Zellen verwendet werden, da hierfür sehr anspruchsvolle Kalibrationen erforderlich sind. Dieses Problem konnte die Firma Impetux mit der Entwicklung ihres Geräts LunamTM T-40i beseitigen. Das Lunam kann sowohl im klassischen (Kalibrations-)Modus verwendet werden, als auch in einem neuartigen und patentierten zusätzlichen Modus, der auf der Bestimmung von Änderungen im Impuls des verwendeten Lichtes beruht (1). So können Kräfte im pN-Bereich auch in komplexen Medien (z. B. Zellen) und unter realistischen Bedingungen (z. B. nicht kugelförmige Objekte) einfach gemessen werden. Integriert in die optische Pinzette Tweez250 von Aresis kann eine Plattform angeboten werden, die prädestiniert ist für die Bestimmung von Kräften in lebenden Zelle.
Beispiel: Kinesin in lebenden A549-Zellen
Abb 3: LunamTM T-40i montiert auf ein Nikon Mikroskop, das mit der optischen Pinzette Tweez250 von Aresis ausgestattet ist.
Für die Messung der Kräfte, die Kinesin innerhalb einer Zelle aufbringt, wurde das beschriebene System verwendet. Mit der optischen Pinzette wurde ein Lipid-Tröpfchen festgehalten, das von einem Kinesin-Molekül aus dem Zellinneren in Richtung Zellperipherie transportiert wurde. Wenn die Kraft, die das Kinesin aufbringen muss um am Cytoskelett entlang zu wandern, ca. 4 pN übersteigt, bleibt eine weitere Wanderung aus. In Abbildung 1 wird gezeigt, dass die von Kinesin aufgebrachte Kraft beim Festhalten des Lipidvesikels linear auf ca. 4 pN ansteigt, dann eine kurze Plateauphase durchläuft und sehr schnell auf null zurückfällt. Es ist bekannt, dass die Kraft bei der das Kinesinmolekül sich vom Cytoskelett löst ca. 4 pN beträgt. Aus den gemessenen Daten ergibt sich zudem, dass sich der Kinesin/Lipidvesikel-Komplex vom Cytoskelett löst, wobei die vom Kinesin aufgebrachte Kraft auf null abfällt.
Abbildung 2 zeigt die Verteilung der zur Ablösung von Kinesin von Cytoskelett führenden Kraft für 400 Messungen. Das Histogramm zeigt ein Maximum bei 3,2 pN und Vielfachen davon. Dieser Wert ist in Übereinstimmung mit anderen Literaturangaben (2).
Literatur:
(1) M. Montes-Usategui and A. Farré, US Patent 20120068059 A1.
(2) B. H. Blehm, T. A. Schroer, K. M. Trybus, Y. R. Chemla, and P. R. Selvin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 3381-3386 (2013).
