QCM-D zur Verbesserung von Wirkstoff-Formulierung und -Lagerung
Aggregation ist ein wichtiger Faktor bei Entwicklungs- und Herstellungsprozessen von Proteinen. Durch ein besseres Verständnis dieser Prozesse kann auch die Haltbarkeit von Endprodukten verbessert werden.
Beispielsweise ist der Verlust an wirksamen Bestandteilen von (oftmals sehr teuren) therapeutischen Proteinzubereitungen durch Aggregation an Behälterwänden (aus Kunststoff, Glas oder Metall) ein kritisches Problem. Doch leider ist das Wissen um die Mechanismen, die der Aggregation zugrunde liegen, noch sehr lückenhaft. Die Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsmessung (QCM-D) von Q-Sense wurde zur Untersuchung solcher Prozesse erfolgreich eingesetzt. In den beiden hier vorgestellten Studien wurde QCM-D verwendet, um
- zwei Arten monoklonaler Antikörper (mAb1 und mAb2), die sich in Hydrophobizität und Selbstoligomerisation stark unterscheiden, bezüglich ihrer Adsorptionseigenschaften auf verschiedenen Materialien (SiO2, Polystyrol, AF1600 und Gold) in An- und Abwesenheit des Surfaktants Polysorbat-80 (PS-80) zu untersuchen [1].
- den Protein-Wirkstoff Abatacept und seine Wechselwirkung mit einer Silikonöl-Wasser-Grenzschicht zu analysieren (Spritzen können z.B. mit Silikonöl, das bekanntermaßen die Aggregation von Proteinen stark fördert, behandelt sein). Zusätzlich wurde in der Studie der Einfluss der oberflächenaktiven Substanzen PS-80 und Poloaxamer 188 untersucht [2].
In beiden Studien wurden Massenänderungen der Sensoren durch die Auswertung der Frequenz- und Dissipationsänderungen mit QTools ermittelt. Beide Studien wurden bei 25 °C durchgeführt.
Abb 1a: Masse der gebundenen Antikörper mAb1 und mAb2 (1 mg/ml), bestimmt durch Modellieren von QCM-D Daten mit QTools.
+ und – zeigen die An- bzw. Abwesenheit von PS-80 an.
Abb. 1b: Masse des gebundenen Antikörperfilms von mAb1 und mAb2 abhängig von der Konzentration. L symbolisiert Versuche mit 1 mg Protein/ml, H steht für 50 mg/ml. Alle Versuche wurden in Anwesenheit von PS-80 durchgeführt.
Abb. 3: Frequenz- und Dissipationsänderung bei Zugabe von PS-80 bzw. Poloxamer 188 zu einer Abatacept-Lösung
Ergebnisse
In der Antikörper-Studie konnte gezeigt werden, dass mAb2 auf allen Oberflächen stärker adsorbiert als mAb1. Die Anwesenheit von PS-80 hat die Adsorption beider Antikörper signifikant reduziert, wobei beide Antikörper auf Gold dennoch stark adsorbieren (siehe Abbildung 1a). Dies könnte durch die elektrostatische Anziehung zwischen dem positiv polarisierten Protein und der negativ polarisierten Metalloberfläche erklärt werden, die vom nicht-ionischen Surfaktant nur schwer beeinflusst werden kann. Die Konzentrationsabhängigkeit der Adsorption zeigte unterschiedliche Ergebnisse für die Adsorption auf PS, AF1600 und Gold, während auf SiO2 wenig Einfluss sichtbar wurde (Abbildung 1b).
In der Studie mit dem Proteinwirkstoff Abatacept wurde dessen Adsorption an eine Silikonöl/Wasser-Grenzschicht untersucht. Dazu wurde das Silikonöl auf die SiO2-Sensoren durch Spincoating aufgebracht. Es zeigte sich, dass der oberflächenaktive Wirkstoff PS-80 die Menge und Kompaktheit des adsorbierten Abataceptfilms im Vergleich zum Blindversuch verringerte, während Poloxamer 188 keinen Effekt hatte.
Eine mögliche Erklärung für den Effekt von PS-80 ist, dass die Adsorptionskinetik von PS-80 mit ca. zwei Minuten signifikant schneller ist als von Abatacept, das einen Gleichgewichtszustand erst nach ca. 12 Minuten erreicht (Abbildung 2). Es ist möglich, dass PS-80 einen Schutzfilm bildet, der bereits ausgebildet ist, solange Abatacept noch nicht fertig adsorbiert hat, während Poloxamer 188 viel langsamer an die Oberfläche bindet (ca. 10 min) und daher die Aggregation nicht beeinflussen kann (Abbildung 3).
Zusammenfassung
Die Beispiele zeigen, dass QCM-D ein wertvolles Werkzeug ist, um die Proteinaggregation auf unterschiedlichen Oberflächen, die in der Produktion und Verarbeitung von Proteinen eine wichtige Rolle spielen, zu untersuchen. Ein besseres Verständnis dieser Vorgänge kann den Wirkstoffverlust verringern und ein besser charakterisiertes Endprodukt ermöglichen.
Literatur
[1] Anna Oom, Mark Poggi, Jennie Wikström and Mupalla Sukumar.
Surface interactions of monoclonal antibodies characterized by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation; Impact of hydrophobicity and protein self-interactions. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 101, 519-529.
Gemeinsame Publikation von Eli Lilly und Biolin Scientific
[2] Jinjiang Li, Swathi Pinnamaneni, Yong Quan, Archana Jaiswal, Fredrik I Andersson, Xiaochun Zhang.
Mechanistic understanding of protein-silicone oil interactions. Pharm Res. 2012 [Epub ahead of print].
Gemeinsame Publikation von Bristol-Myers Squibb und Biolin Scientific
